Département de Biologie

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Browsing Département de Biologie by Subject "Actinomycète : productrice d'enzyme : intérêt biotechnologique"

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    Séléction de souches d'actinomycètes productrices d'enzymes d'intérêt biotechnologique
    (Universite Mouloud MAMMERI Tizi-Ouzou, 2019) Chergui, Achour
    La L-Asparaginase est l’enzyme qui hydrolyse la L-Asparagine en acide L-Aspartique et ammoniaque. Elle est utilisée en chimiothérapie anticancéreuse pour l’inhibition de la prolifération des cellules tumorales. Parmi les micro-organismes producteurs, les actinomycètes sont de puissantes machines biologiques à synthétiser la L-Asparaginase. Dans le but de chercher de nouvelles molécules de L-Asparaginase, nous avons isolé 17 souches d’actinomycètes à partir de différentes sources : le son de blé ; les eaux du lac Agoulmim situé au Mont Tikjda (Djurdjura) et le sol rocheux de la commune de Mekla (W. Tizi-Ouzou). Parmi celles-ci, 12 étaient productrices de l’enzyme recherchée dont deux, CA01 et CA04 sélectionnées, ont été identifiées sur la base de leur caractères morphologiques, biochimiques, physiologiques et moléculaire ayant révélé un degré de similarité de 99% de la séquence du gène codant l’ARNr 16S au genre Streptomyces avec un taux d’identité à l’espèce de 99% à Streptomyces hydrogenans CA04 et de 99,73% lié à Streptomyces paulus CA01. Après standardisation de la production de la L-Asparaginase extracellulaire, suivant le plan OFAT et l’optimisation par la méthode des surfaces de réponse (RSM) du Box Behnken Design (BBD) réalisée avec le logiciel Minitab17, il s’est avéré que la souche Streptomyces paulus CA01 produit un maximum d’activité L-Asparaginase extracellulaire de 8,03UI/ml, dans les conditions optimales en (g/L) de : L-Asparagine 10,7 ; glucose 2,7 ; amidon 7 à une température de 27,83°C, et un maximum d’activité L-Asparaginase intracellulaire de 8,27UI/ml dans les conditions optimales en (g/L) de : L-Asparagine 11,9 ; glucose 2,6 ; amidon 7 à une température de 27.5°C. Tandis que la souche Streptomyces hydrogenans CA04 a produit uniquement la L-Asparaginase extracellulaire, avec un maximum de 5,98UI/ml dans les conditions optimales en (g/L) de : L-Asparagine 7,5 ; glucose 1,0 à une température de 25,76°C, sur un milieu de base ADS contenant en plus en (g/L): K2HPO4 0.5; MgSO4-7H2O 0.1 et une durée d’incubation de 6 jours. Les enzymes détectées sont extraites respectivement à 80% et 90% de saturation au sulfate d’ammonium, pour les souches CA01 et CA04, suivie d’une dialyse over-night, une séparation chromatographique sur Séphacryl S-200 et une PAGE-SDS en conditions non dissociantes. Ce qui a révélé la présence de deux isoenzymes extracellulaires dans chaque extrait, à des PM respectifs de 114KDa et 91KDa pour la souche CA01 et 108KDa et 86KDa pour CA04 et une enzyme intracellulaire à 51KDa produite par CA01. Les fractions extracellulaires actives de rendement élevé, à savoir A1 produite par CA01 et A4 produite par CA04 sont caractérisées, respectivement par des activités spécifiques de 6,55UI/mg et de 2,33UI/mg ; des rendements de 68,92% et 64,06% ; des activités résiduelles de 3,36% et 2,74% vis-à-vis de la L-Glutamine et 0,18% et 0,36% vis-à-vis de l’acide L-aspartique ; des cinétiques enzymatiques caractérisées par des Vmax de 5,36UI/ml et 3,44UI/ml ; KM de 1,2.10-2M et 2.10-2M ; des Vi de 1,02UI/ml et 0,36UI/ml. Les deux isoformes choisis présentent des activités importantes à pH entre 7 et 8,6 avec un optimum à pH8 et à des températures allant de 35 à 40°C avec des optimums à 37°C. Les activités des deux isoformes A1 et A4 sont réduites en présence de Fe2+ et disparaissent en présence de Mn+. Cependant l’activité d’A1 est améliorée en présence de Zn+.